密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理是：常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll)-泛影葡胺（Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，_W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
方法：
1、在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2、取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3、离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4、用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5、末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
更新时间：2022-09-21 
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