食道癌（EAC）是全球top6高致死率的癌症。NDB是已知的EAC前体病变，表现为食管的正常鳞状粘膜被柱状上皮覆盖。其可经历低度异性增生（LGD）到高度异型增生（HGD），最终发展到食道癌。在过去的几十年里，食道癌的发病率急剧增加。因此迫切的需要更好地了解疾病的病因，并识别新的预后和预测性生物标志物，以提高患病的生存概率。在本文中，科学家们选取了17位不同的食道癌患者的样本，进行了综合的数据分析。基于这些数据，共形成了3种生物型，共有119个表达谱，包括miRNA（51）、mRNA（51）和circRNA（17）。善用这种特别的数据资源，有助于发现新的生物标志物和疾病机制，进行组织和液体活检的比较，整合编码和非编码RNA模式，此外还可以作为其他基于RNA研究的验证方式。此外，在该数据集中还可以识别出结构RNA的差异，包括蛋白质编码突变、融合基因和环状RNA。该文由比利时根特大学Katleen De Preter团队于2022年3月在Nature 子刊scientific data 上发表。

图 1 实验线路设计

实验方法：

患者样本收集
该项目收集4名食道癌患者（EAC），5名高度异型增生患者(HGD)和8名非增生ba雷特食道症患者(NDB）的共51份血液组织样本。所用样本均在治疗前采集。组织样本是在内镜检查（NDB和HGD）或肿瘤手术切除（EAC）期间获得的。从病变组织区收集至少一个组织样本被送去进行病理检查。若收集到非目标疾病或健康样本则会使用RNAlater（Qiagen 76104 RNA保存液）进行长期保存。血液样本使用6 ml EDTA管收集，然后用9 ml柠檬酸钠（3.2%）真空血管进行采血。1800g离心10 min制备血浆

RNA提取
组织样本：采用miRNeasy mini kit （Qiagen 货号217004）抽提总RNA。提取后的RNA由QUBIT进行浓度测定，由安捷伦片段化分析仪进行RNA 完整性质控。其中高达70.6%的样本的RNA完整性水平大于质控数字指标7，表示质量较好。
血浆样本：采用miRNeasy Serum/Plasma Kit （Qiagen 货号217184）提取RNA，其中用来mRNA捕获测序的样本还进行gDNA去除。

测序
组织样本：PolyA+ RNA 测序
采用TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit （Illumina）进行测序文库构建，上样量为100 ng。用安捷伦片段化分析仪进行文库质控，终文库在NextSeq 500（Illumina）仪器上进行paired-end测序。
血浆样本：mRNA捕获测序
使用TruSeq RNA Access Library Prep Kit (Illumina,现已更名为TruSeq RNA Exome)进行文库制备，上样量为8.5 µl RNA洗脱液。使用安捷伦片段化分析仪进行文库质控。样品在NextSeq 500（Illumina）仪器上进行paired-end测序。对所有样本进行了两次测序，以获得适当的测序深度。

Small RNA 测序
使用NEBNext  small RNA library prep kit进行文库制备，上样量为100 ng （组织样本）和 6 µl 总RNA（血浆样本）。采用Pippin Prep系统，选择含有成熟miRNAs（~147-157nt片段）文库根据qPCR定量进行归一化并进行汇总，并且用乙醇沉淀浓缩，用Qubit 2.0荧光仪定量。在NextSeq 500（Illumina）仪器上对组织和血浆样本进行单端测序。

 图 2 数据的技术验证 a）RNA原始reads测序数据的质量图：mRNA组织和血浆数据的每个碱基平均质量（上行），以及miRNA组织和血浆数据（下行）； b)基于皮尔逊相关系数的mRNA血浆样本的分层聚类，显示了EAC样本与HGD和NDB样本的聚类； c）热图显示组织（左）和血浆（右）样本中35个重叠的不同表达基因（上下）的相对表达量； d）血浆中shi大丰富环状RNA的相对表达（EAC vs NDB）； e）与匹配的健康食管组织相比，四种最常见的EAC、HGD和/或NDB组织样本中上调和下调的miRNAs

表 1 组织样本（包括19734个基因和676个miRNAs）和血浆样本（11255个基因，457个miRNAs和2275个环状RNA）的表达和丰度分析结果

结论：
1、基因表达和丰度分析
对组织和血浆中的mRNA、miRNA和环状RNA进行了同源基因表达和丰度分析。不同表达基因的数量见表1。预处理后的数据也被上传到R2 Genomics Analysis and Visualization Platform 中，可对数据集的进一步探索和可视化。在本研究中，我们在EAC、HGD和NDB患者的血浆中鉴定了几种环状RNA，它们的环状结构更能抵抗外切酶的RNA降解，因此这种类型的RNA作为循环生物标记物具有很大的潜力。虽然我们关注使用小RNA测序数据进行miRNA表达和丰度分析，但其他小RNA如tRNA（片段）和piRNA也可以使用我们的数据进行分析。

2、相关miRNA和mRNA的表达
该数据集包含了匹配疾病和健康组织样本的miRNA和mRNA数据。因此，我们在数据中可以研究miRNA和mRNA表达之间的关系。例如，已知Hedgehog（HH）信号通路在EAC和NDB60中发挥重要作用。在NDB中，hsa-miR-194表达的增加导致SUFU的丢失，从而导致Sonic Hegdgehog（SHH）基因的上调。在我们的NDB组织数据以及EAC和HGD组织样本中，也观察到与健康组织相比，hsa-miR-194和SHH的表达上调，以及SUFU的表达下调。这种特别的数据集可对疾病和健康部分数据进行匹配，以便进一步探索相关通路，即通过使用miRNA和mRNA数据。

3、突变分析
基于polyA+测序数据（组织）和mRNA捕获测序数据（血浆），进行突变分析。疾病特异性变异被严格筛选。随后，这些变异与血浆中的变异进行分析。在2例EAC患者、5例 HGD患者和4例NDB患者的血浆中，共发现了24个变异。每个患者发现1-7个变异，但在疾病组内或组间没有观察到重叠。根据前列腺癌（COSM5564582）、宫颈癌或胆道癌（COSM5493837）或大肠癌（COSM5756079）的COSMIC 数据库，树状变异是已知的肿瘤突变。这些结果证明了该数据集能够在血浆RNA测序数据中识别可能的体细胞突变或疾病特异性RNA编辑事件。

4、融合基因分析
EAC组织中融合基因分析的研究报道很少。在本文中，科学家们展示了检测EAC、HGD和NDB组织和血浆样本的融合基因的潜力。在组织样本中，在所有样本中都发现了潜在的融合基因。通过排除（在每个样本的基础上）在健康组织中也发现的融合基因，我们确定了疾病特异性的融合基因。对于所有的样本，有2-14个融合基因保留（不包括潜在的假阳性）。对于血浆样本，在一个HGD患者样本和两个NDB患者样本中识别出潜在的融合基因，其中有两个重叠的融合基因（ID5_HGD和ID19_NDB）。疾病组织与血浆样本之间没有融合基因的重叠。科学家们仍然需要进一步验证这些潜在相关的融合基因。

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Reference：Schoofs, K., Philippron, A., Avila Cobos, F. et al. Comprehensive RNA dataset of tissue and plasma from patients with esophageal cancer or precursor lesions. Sci Data 9, 86 (2022)

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