嵌合自身抗体受体T细胞精确靶向自身抗原特异性B细胞-重症肌无力肌肉特异性酪氨酸激酶

背景部分介绍：

肌肉特异性酪氨酸激酶重症肌无力(MuSK MG)是一种由MuSK自身抗体引起的慢性自身免疫性疾病，可导致潜在危及生命的肌肉无力。MuSK是一种跨膜受体，与神经元蛋白聚糖agrin复合物中的脂蛋白受体相关蛋白4 (LRP4)相互作用，导致MuSK磷酸化并形成高密度乙酰胆碱受体(AChR)簇，这是神经肌肉连接突触传递所必需的。

MuSK MG疾病的严重程度与抗MuSK抗体滴度相关，特别是针对MuSK Ig1结构域的IgG4自身抗体，它会破坏MuSK- LRP4的相互作用。使用利妥昔单抗消耗B细胞导致抗MuSK IgG相对于总IgG11减少，表明MuSK自身抗体主要由短寿命浆细胞产生。利妥昔单抗后疾病复发归因于B细胞不wan全耗尽，需要反复输注利妥昔单抗来控制疾病，但慢性B细胞耗尽有严重感染的风险。理想情况下，治疗应仅消除致病的anti-MuSK B细胞，保留健康的B细胞，以实现MuSK MG的持久缓解，而不产生全身性的免疫抑制。

在这里，作者报道了一种嵌合自身抗体受体(CAAR)的设计和功能验证，该受体包含MuSK自身抗原，连接到串联CD137-CD3ζ信号域。MuSK-CAAR在T细胞中的表达对表达anti-MuSK表面自身抗体或B细胞受体(BCR)的B细胞具有细胞毒性。MuSK-CAAR T细胞(MuSK-CAART)技术基于临床批准的抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CART-19)疗法，该疗法已导致B细胞恶性肿瘤的wan全和持久缓解。作者在临床前模型中研究了MuSK-CAART的疗效和安全性，这支持MuSK-CAART作为一种精确的细胞免疫疗法，具有诱导MuSK MGwan全和持久缓解的潜力。

主要结果部分：

1.MuSK-CAAR靶向疾病相关的抗MuSK B细胞表位

MuSK是一种跨膜酪氨酸激酶，其外域包括三个免疫球蛋白样结构域(Ig1-Ig3)和卷曲样结构域(Fz)。估计有100%, 58%和23%的MuSK MG患者的血清可以识别Ig1, Ig2和Ig3-Fz结构域。为了靶向抗MuSK B细胞，作者设计了一个MuSK-CAAR，包含完整的MuSK外域，连接CD137-CD3ζ共刺激和激活域，并证实了在原代人T细胞上的表达(a, b)。

为了验证MuSK-CAART的细胞毒性，作者从3例MuSK MG患者或3只MuSK免疫小鼠中分离了表达抗MuSK结构域特异性BCR的Nalm-6 B细胞。MuSK- CAART证明了Nalm-6细胞针对每个MuSK结构域的特异性裂解，但不裂解Nalm-6细胞(c–g)。共培养24小时比共培养5小时特异性细胞毒性增加。在MuSK-CAART与抗MuSK Nalm-6共培养的上清液中检测到IFNγ，但对照组未检测到IFNγ (h)。

2. 可溶性抗MuSK抗体对MuSK-CAART细胞毒性、IFNγ产生和增殖的影响

MuSK自身抗体可能会阻断MuSK- CAART与抗MuSK BCR的结合(浆细胞)，但它们也可能通过激活来增强细胞毒性MuSK-CAART。MuSK- caart对混合靶细胞(13-3B5/3-28/24C10/192-8(抗ig1 /Ig2/Ig3/Fz))的细胞毒性被MuSK MG患者的多克隆IgG部分抑制，但特异性细胞毒性普遍随着效应靶比的增加和共孵育时间的延长而增加（a）。当与Nalm-6对照和来自MuSK MG患者的IgG一起培养时，MuSK- CAART和NTD-T产生同样低水平的IFNγ(b，左)当与抗musk Nalm-6细胞共培养时，在MuSK-CAART中观察到IFNγ相对于NTD-T(nontransdused)的产生(b，右，黑色和红色条)。MG患者IgG 对IFNγ水平无明显影响，尽管观察到有较低水平的趋势(b，右，红条)。

为了确定抗MuSK抗体对MuSK-CAART的直接影响，将MuSK-CAART与抗MuSK单抗(13-3B5(抗Ig1)/3-28(抗Ig2)/24C10(抗Ig3)/192-8(抗fz))孵育。Anti-MuSK单抗(混合或单独)以浓度相关的方式诱导IFNγ的产生和MuSK-CAART的增殖(c, d)。

3. MuSK-CAART通过BCR靶向anti-MuSK B cell的效果与anti-CD19 CART介导的cell溶解相当

生物发光成像表明，相对于NDT-T, CART-19和MuSK-CAART显著降低了Nalm-6的生长(a, b)，尽管在MuSK-CAART治疗和CART-19治疗的一小部分小鼠中观察到生物发光通量信号的复发。在移植了Nalm-6 13-3B5细胞的CART -19处理小鼠中，Nalm-6的复发不是由于T细胞的丢失，因为在大多数CART-19处理的小鼠中都可以检测到T细胞(c)。

在混合Nalm-6和13- 3b5移植的小鼠中观察到更高的MuSK-CAART百分比(c)，可能是由于可溶性单克隆抗体诱导的MuSK-CAART在靶细胞遭遇后在体内扩增或增殖。与MuSK-CAART输注产物相比，脾脏分离的T细胞中MuSK-CAART的表达保持稳定(d)。然而，与CART-19输注产物相比，脾脏T细胞中的抗CD19 CAR表达较低(d)，这可能解释了CART-19治疗小鼠中Nalm-6复发的原因。

在13- 3b5异种移植小鼠中，NTD-T处理小鼠的抗MuSK抗体滴度在第5天至第15天增加，而CART-19和MuSK-CAART处理小鼠的滴度在T细胞注射后第15天和第11天明显低于NTD-T处理小鼠(e)。与NTD-T处理的小鼠相比，CART-19-和MuSK-CAART处理的小鼠与膈肌细胞结合的抗MuSK IgG也减少(f)。

综上所述，这些数据表明，MuSK-CAART可以靶向MuSK Ig1/Ig2/Ig3/Fz结构域特异性细胞具有与CART-19相当的疗效。

4. 在MuSK EAMG模型中，MuSK-CAART降低Anti-MuSK的IgG，但不降低总IgG

治疗后，1D3-CART治疗小鼠的脾脏和淋巴结中几乎没有检测到B细胞，而NTD-T和MuSK-CAART治疗小鼠的B细胞频率相当(b)。抗MuSK抗体滴度在治疗前各组间具有可比性(c)， NTD-T治疗小鼠的抗MuSK抗体滴度逐渐升高，而MuSK- CAART-和1D3 -CART治疗小鼠的滴度在注射后1周开始显著降低(d)。与1D3-CART显著降低血清总IgG不同，相对于NTD-T处理的小鼠，MuSK-CAART没有降低血清总IgG水平(e)。

CD45.1+ T细胞在脾脏和淋巴结中发现MuSK-CAART-treated T细胞比例相对较低的小鼠,和更高的T细胞比例在1D3-CART-treated小鼠,后者在一定程度上由于两个更多的T细胞注射在组1中,除了罕见的anti-MuSK B细胞相对于CD19-expressing B细胞免疫小鼠和/或不同的信号和costimulatory域MuSK-CAAR和1D3-CAR(f)。

另外，作者还检测了MuSK-CAART的脱靶细胞毒性和对肌肉的脱靶效应，均未观察到。

模式图：

最后，针对文章的研究，小优博士在这里制作了一张模式图，供大家参考。虽然MuSK-CAART和CART均靶向浆细胞上的BCR复合体结合并杀伤浆细胞，但MuSK-CAART嵌合的是自身抗原MuSK受体，与BCR可变区特异性结合，仅仅杀伤针对MuSK产生抗体的浆细胞，与CART（嵌合抗体受体，杀伤所有浆细胞）相比，具有明显的优势。因此CAART作为CART反向构思的结果，在针对自身免疫性疾病方面具有潜在的巨大的研究价值。

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